فحص عينات البراز , Stool specimen

التهاب الأمعاء Gastroenteritis

عينات البراز Stool specimen :

تكون القناة الهضمية عند المواليد معقمة وتبدأ الجراثيم بالدخول إليها عبر الطعام والشراب فيتكون مجتمعاً ميكروبياً يتعايش مع الإنسان داخل جهازه الهضمي وهو ما يعرف normal flora ويزداد عدد هذه الكائنات كلما اتجهنا إلى أسفل الجهاز الهضمي بالرغم من وجود الحمض المعوي ووجود إنزيم الببسين الهاضم للمكونات البروتينية ولكن يزداد هذا العدد في الأمعاء الدقيقة والغليظة أكثر لوجود المواد الغذائية داخلها لمدة طويلة مما يعطي فرصة لهذه الكائنات بالزيادة العددية لها .
وتحدث التهابات القناة الهضمية نتيجة الإصابة بعدة أنواع من المسببات كالبكتيريا والطفيليات والفيروسات فيحدث ألم أو غثيان أو قيئ أو إسهال وقد يصاحب ذلك الحمى كعرض من أعراض التهاب القناة الهضمية .
الجراثيم الممرضة التي قد توجد في الجهاز الهضمي :

1- الفيروسات مثل Rotavirus و Norwalk agentvirus و Adenovirus .
2- الطفيليات Parasite مثل :
Entamoeba histolytica و Giardia lamblia .
3- البكتيريا ومنها حسب الجدول التالي :

الأنواع الأكثر شيوعاً —–الأنواع الأقل شيوعاًSalmonella —– Staphylococcus aureusShigella —– E.coliVibrio spp. —– Clostridium perfringensYersinia enterocolitica —– Aeromonas

Cambylobacter jejuni—— Bacillus cereus
Mycobacterium tuberculosis

وتستخدم عدة عينات للكشف عن مسببات الإلتهاب مثل :
1- مسحة من المستقيم rectal swab أو من فتحة الشرج .
2- خزعة من الأمعاء Gastric biopsy .
3- الدم للزراعة أو للكشف عن الأجسام المضادة في مصل الدم .
4- البراز Stool وهي الأكثر شيوعاً .

مراحل فحص عينة البراز :
1- الفحص الظاهري macroscopic examination :

يلاحظ قوام ولون العينة ووجود المخاط والدم وأطوار الديدان وذلك بالعين المجردة .

2- الفحص المجهري microscopic examination :

يعمل شريحة من عينة البراز بطريقة التحضير الرطب إذا كان المسبب من الفطريات مثل Candida spp. أو الطفيليات فيلاحظ أطوارها مثل الديدان والأميبا وغيرها .
كما ويستخدم الميكروسكوب لملاحظة خلايا الدم الحمراء والبيضاء دلالة على وجود الألتهاب.

3- زراعة عينة البراز :

تستخدم هذه الخطوة لعزل مسبب المرض خاصة البكتيريا ولابد من ملاحظة ما يلي :
1- لاتزرع عينة البراز في الظروف اللاهوائية لأن معظم الساكن الطبيعي من البكتيريا في الأمعاء لاهوائي ومسببات المرض هي من النوع الهوائي الإختياري .
2- استخدام الأوساط الإختيارية والتفريقية لتثبيط الساكن الطبيعي وتنمية البكتيريا المسببة للمرض فقط . ويجب أن تكون هذه الأوساط الغذائية تغطي جميع أنواع البكتيريا الشائعة المسببة للمرض ( كما هو موضح في الجدول السابق ) .
3- يمكن استخدام صبغة جرام لمعرفة كون المرض ناتجاً عن البكتيريا نفسها أم عن السموم التي تفرزها ولاتستخدم هذه الصبغة كمرحلة تشخيصية لكثرة الأنواع البكتيرية المسببة لالتهابات الأمعاء .
يفضل عزل الأنواع المختلفة على بيئات خاصة كما سيرد ( وهي الطريقة الدارجة في المختبرات ) :

أ‌- عزل بكتيريا Salmonella and Shigella :

ويتم عزل هذين النوعين من البكتيريا على عدة أوساط وهي :
1- تستخدم أوساط مفرقة واختيارية جزئية مثل Macconkey agar أو EMB حيث يعتبر هذين الوسطين من الأوساط المفرقة التي تميز بين البكتيريا الموجبة والسالب لصبغة جرام حيث ينمو عليها البكتيريا السالبة لجرام فقط كما أنها تميز البكتيريا المخمرة لسكر اللاكتوز وغير المخمرة لاحتواء هذين الوسطين على اللاكتوز في تركيبهما . فالبكتيريا المخمرة للاكتوز تظهر كمستعمرات وردية وغير المخمرة تظهر مستعمراتها شفافة غير ملونة وتعتبر كل من Salmonella and Shigella غير مخمرة للاكتوز لذا تكون مستعمراتها شفافة غير ملونة على هذين الوسطين .
2- تستخدم البيئات التالية كونها مثبطة للساكن الطبيعي في الأمعاء وتنمي Salmonella and Shigella فقط وهي :
** تزرع العينة على بيئة Salmonella Shigella agar و Desoxy cohlate citrate agar و Kauffmann-brilliant green agar تمنع الأخيرة نمو كثير من البكتيريا المعوية وخاصة E.coli and Proteus وتسمح بنمو السالمونيلا والشايجيلا . وتعمل هذه البيئات كمفرق للبكتيريا المخمرة للسكر والتي تظهر كمستعمرات وردية اللون وبما أن السالمونيلا والشايجيلا غير مخمرة للسكر فتظهر كمستعمرات عديمة اللون كما سبق ذكره .
** بيئة Leifson selenite broth أو Mueller tetrathionate broth :
تحتوي على مواد كيميائية مثل Citrate , desoxycholate , tetrathionate تمنع نمو البكتيريا الموجبة لجرام وتنشط نمو السالمونيلا والشايجيلا .

** بيئة Hektoen enteric agar :
يعتبر هذا الوسط اختياري لاحتوائه على تركيز عال من أملاح الصفراء Bile salt كما يعتبر وسطاً مفرقاً نظراً لاحتوائه على الكربوهيدرات فيفرق بين البكتيريا المخمرة للسكر ومنتجة لغاز H2S عن غيرها من الأنواع .
يكون لون هذا الوسط في العادة أخضراً وتظهر المستعمرات المخمرة للسكر باللون الأصفر .
وبما أن Salmonella and Shigella غير مخمرة للسكريات لذا تظهر مستعمراتها شفافة عديمة اللون . ولكن تظهر مستعمرات Salmonella فقط على هذه البيئة في منتصفها نقطة سوداء بسبب انتاج غاز H2Sالذي يترسب باللون الأسود على المستعمرة وهذه الخاصية تميز بكتيريا Salmonell عن Shigella .
ملاحظة : تشترك صفة إنتاج غاز H2S مع بكتيريا Salmonell كل من بكتيريا Proteus , Providencia , Morganell .
** بيئة Xylose lysin deoxy cholate ( XLD ) :
هذه البيئة ذات لون أحمر يتحول للون الأصفر عند نمو بكتيريا مخمرة للسكر عليه ويعتبر وسط ملائم لعزل بكتيريا Sigella .

3- تستخدم بيئات خاصة عالية الإختيارية ومفرقة بشكل خاص لبكتيريا Salmonella and Shigella مثل بيئة Bismuth sulfite agar الخاصة بتنمية بكتيريا Salmonella فقط لاحتوائه على تركيز عالي من صبغة Brilliant green وأملاح Bismuth فيكون لونه رمادياً لامعاً . وعند نمو بكتيريا Salmonella typhi تظهر مستعمراتها بلون أسود محاطة بمنطقة خضراء لامعة وبقية الأنواع من هذه البكتيريا ( Salmonella ) فتظهر إما شفافة أو خضراء أو سوداء .
4- تستخدم بيئات اختيارية إغنائية وهذه الأوساط سائلة تستخدم للقضاء على كافة أنواع البكتيريا الموجودة في عينة البراز وتنشط نمو بكتيريا Salmonella و Shigella وذلك بحقن كمية بسيطة من البراز غي البيئة ثم تحضينها لمدة 10 – 18 ساعة ثم يتم عمل زراعة أخرى sub culture على أوساط مفرقة للتمييز بين بكتيريا Salmonella و Shigella .
ومن هذه الأوساط Selenite broth , Tetrathionate broth , GN broth .

خطوات عزل وزراعة البكتيريا من عينة البراز :

1- خذ كمية من البراز بواسطة ماسحة قطنية معقمة .
2- ازرع العينة بالتخطيط بواسطة الماسحة القطنية على وسطين من الأوساط التالية مع تفضيل أن يكون أحدهما خاص ببكتيريا Salmonella , Shigella .
مثل SS agar , Hekton enteric agar , Brilliant green agar , Desoxy cholate citrate agar .
ويفضل زرع عينة البراز في وسط إغنائي Selective enrichment media مثل Selenite broth أو GN broth وبعد التحضين 18 ساعة تقريباً يعمل تخطيط على أحدى البيئات السالفة الذكر بواسطة إبرة التلقيح .
3- تزرع العينة من الوسط الإغنائي أيضاً على بيئة EMB أو Macconkey agar أو Desoxycholate agar .
4- تزرع العينة أيضاً على بيئة Bismuth sulfite agar لعزل بكتيريا التيفوئيد وتشخيصها إن وجدت .
5- يتم تحضين الأوساط المزروعة لمدة 24 ساعة عند 35 ْم وقد يلزم بيئة Bismuth فترة أطول .
النتائج : تدرس الأطباق المزروعة تحت إضاءة جيدة للبحث عن النتائج التالية :
تظهر مستعمرات Salmonella , Shigella شفافة على الأوساط السابقة وتظهر مستعمرات Salmonella typhi سوداء اللون على بيئة Bismuth sulfate agar .

عزل بكتيريا Yersinia enterocolitica :
يستخدم وسط Cefsulodin irgasan novobiocin ( CIN ) agar كوسط اختياري خاص لعزل بكتيريا Yersinia من عينة البراز وذلك لاحتوائه على مواد غذائية خاصة لهذه البكتيريا بالإضافة للمضادات الحيوية .
يتم زراعة العينة على الوسط السابق ثم يحضن لمدة 48 ساعة عند درجة حرارة الغرفة . وبعد فترة التحضين تظهر مستعمرات Yersinis بلون زهري لامع ذات مركز أحمر .
وتظهر بعض أنواع البكتيريا هذه الصفة مثل Citrobacter , Aeromonas وللتمييز بينها تزرع على وسط Blood agar ثم نقوم بعمل الإختبارات البيوكيميائية . حيث أن Yersinia تعطي نتيجة سالبة لفحص الأكسيديز وبكتيريا Aeromonas تعطي نتيجة موجبة .
يمكن عزل بكتيريا Yersinis enterocolitica على وسط Blood agar , Macconkey agar حيث تنمو هذه البكتيريا على بيئة آجار الدم خلال 24 ساعة مكونة مستعمرات صغيرة سريعة النمو ومتحركة عند درجة حرارة الغرفة وهي غير مخمرة للاكتوز وتعطي نتيجة سالبة لصبغة جرام واختبار الأكسيديز وتعطي نتيجة موجبة لفحص Urease .

عزل بكتيريا Vibrio cholera :
تنمو هذه البكتيريا المسببة لمرض الكوليرا على عدة أوساط ولكن بيئة Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar ( TCBS ) من أفضل الأوساط المميزة لهذه البكتيريا حيث تظهر بكتيريا Vibrio cholera كمستعمرات صفراء اللون بينماالنوع
Vibrio parahaemolyticus يعطي مستعمرات خضراء اللون على هذا الوسط .

عزل بكتيريا Campylobacter :
تستخدم أوساط اختيارية خاصة بتنمية هذه البكتيريا مثل Campy-blood agar
و Skirrows media حيث تزرع العينة على الوسط ثم تحضن عند درجة 42 ْم لمدة 48 ساعة بوجود 10 % ثاني أكسيد الكربون .
ويعتبر وسط Campy-blood agar أفضل في تنمية بكتيريا Compylobacter jejuni بينما الآخر قد يستعمل لتنمية بقية أنواع هذه البكتيريا .

عزل بكتيريا Helicobacter pylori :
تسبب هذه البكتيريا قرحة المعدة والإثنا عشر وتعزل بأخذ خزعة من مكان التقرح ثم إجراء أحد الفحوصات التالية عليها :
1- عمل مسحة من النسيج المأخوذ ( الخزعة ) وصبغها بصبغة جمسا Giemsa stane لمشاهدة البكتيريا التي تكون منحنية أو لولبية الشكل .
2- تزرع هذه البكتيريا على بيئة Campy-blood agar أو Skirrows media مضافاً لها المضادات الحيوية التالية Trimethoprim , Vancomycin .
ويمكن زراعة العينة على بيئة Chocolate agar مضافاً لها بعض المضادات الحيوية لقتل الكائنات الملوثة للعينة مثل Amphotericin , Nalidixc acid , Vancomycin . ثم تحضن الأوساط المزروعة عند درجة 37 ْم لمدة 3 – 6 أيام فتظهر مستعمرات لامعة ذات قطر يتراوح بين 1 – 2 ملم عند وجود هذه البكتيريا .
3- تنتج هذه البكتيريا إنزيم Urease بقوة لذلك يمكن وضع النسيج في بيئة سائلة Urease media المحتوية على اليوريا بحيث يؤدي إنتاج البكتيريا لإنزيم اليورييز إلى تغير لون الوسط خلال 15 – 30 دقيقة من وضع العينة .

عزل بكتيريا E.coli :
تعتبر من الفلورا الطبيعية التي تعيش في أمعاء الإنسان إلا أن بعض أنواعها تسبب الإسهال لدى الأطفال حديثي الولادة بسبب إفراز السموم مثل النوع المصلي E.coli O157:H7 هو أكثرها شيوعاً .
ويتم زراعتها بأخذ مسحة شرجية أو عينة من البراز وزراعتها على بيئة Blood agar و أوساط اختيارية أخرى مثل Macconkey agar و EMB ثم تحضن الأطباق عند 37 ْم لمدة 24 ساعة وعند ظهور مستعمرات هذه البكتيريا يؤخذ جزء منها ويعرض لأجسام مضادة خاصة بكل نوع مصلي لوحده من أنواع E.coli على شريحة بحيث تعطي النتيجة الإيجابية تخثر للعينة Agglutination . كما يمكن زراعة العينة على بيئة Sorbitol macconkey agar حيث أن 95 % من أنواع بكتيريا E.coli قادرة على تخمير سكر السوربيتول بينما النوع المصلي E.coli O157:H7 يعطي نتيجة سلبية لهذا الفحص .

عزل بكتيريا السل Mycobacterium tuberculosis :
في بعض حالات السل الرئوي وفي حال صعوبة أخذ عينة من البلغم للأشخاص المصابين بهذا المرض يمكن أخذ عينة من البراز لتشخيص مرض السل فيتم زراعة العينة على بيئة Lowenstein-jensen media .

عزل البكتيريا العنقودية الممرضة :
نبحث في هذا العزل على البكتيريا العنقودية Staph. الموجبة لفحص Coagulase فيستخدم لذلك بيئة غنية بأملاح كلوريد الصوديوم مثل Staph. Medium -110 أو Mannitol salt agar .

عزل الفطريات :
قد تتواجد أنواع من الفطريات في الأمعاء مثل Candida albicans بشكل يشبه خلايا الخميرة بشكل طبيعي ولكن عند ضعف مناعة الجسم قد يزداد عددها مما قد يسبب مرضاً . ومما هو جدير بالذكر أن وجود خلايا كالخميرة ليس ذو دلالة مرضية بينما وجودها ووجود خيوط فطرية في العينة يعطي دلالة على المرض .
ويمكن الكشف عنها بعمل تحضير رطب ومشاهدته بواسطة المجهر . كما ويمكن زراعة العينة على أوساط خاصة بالفطريات مثل SDA ( Sugar dextrose agar ) ثم تحضن عند 37 ْم لمدة 24 ساعة وتظهر مستعمرات Candida بيضاء حليبية مشابهة لمستعمرات البكتيريا .